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層析的應用可以根據目的分為製備性層析和分析性層析兩大類。
製備性層析的目的是分離混合物，獲得一定數量的純淨組分，這包括對有機合成產物的純化、天然產物的分離純化以及去離子水的製備等。相對於層析出現之前的純化分離技術如重結晶，層析能夠在一步操作之內完成對混合物的分離，但是層析分離純化的產量有限，只適合於實驗室應用。
分析性層析的目的是定量或者定性測定混合物中各組分的性質和含量。定性的分析性層析有薄層層析、紙層析等，定量的分析性層析有氣相層析、高效液相層析等。層析應用於分析領域使得分離和測定的過程合二為一，降低了混合物分析的難度縮短了分析的周期，是目前比較主流的分析方法。在中華人民共和國藥典中，共有超過600種化學合成藥和超過400種中藥的質量控制應用了高效液相層析的方法。
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